免疫チェックポイント阻害薬から学ぶ、感染症への応用について

はじめに

• 免疫チェックポイント分子は、免疫細胞に発現しているinhibitory recep­torsであり、免疫抑制シグナル経路を惹起する
• これらの分子は、末梢組織における自己寛容の維持とeffector免疫細胞の反応のバランスに重要である
• シグナル経路は、effector免疫細胞（特にT細胞）を"exhaustion"状態へ変化させる
• T細胞の"exhaustion"：effector機能が低下し、免疫チェックポイント分子（PD1など）の発現した状態を維持し、effector T細胞やmemory T細胞とは異なるT細胞
• T細胞と抗原提示細胞の間では、多くの刺激性のシグナルと抑制性のシグナルがあり、これらによって免疫反応を制御している
• 多くの微生物や悪性腫瘍では、免疫反応から逃れるために抑制系のシグナルを促進することがわかっている
• この反応を利用して、悪性腫瘍では新しい治療である免疫チェックポイント阻害薬（ICI）が開発された
• PD-1：pembrolizumab, nivolumab
• Programmed cell death protein 
• T細胞、B細胞、NKT細胞、樹状細胞、活性化単球に発現
• PDL1とPDL2の2つのリガンドがある
• T細胞受容体を刺激されてから24時間以内のT細胞表面で発現が増加
• PD1のリガンドが結合すると、効果は数時間で認める
• 樹状細胞と腫瘍細胞のPDL1による、PD-1を介したT細胞内のシグナルはT細胞受容体からのシグナルを抑制し、T細胞の増加・サイトカイン産生・細胞障害機能を阻害する
• 悪性腫瘍を有するマウスと慢性ウイルス感染症マウスの実験において、CD28-B7共刺激分子経路は、PD-1を標的にした治療では必要不可欠であることがわかった
• CTLA-4：ipilimumab
• Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 
• immunoglobulinスーパーファミリーの1つで、CD28共刺激分子と共に活性化T細胞に発現
• CD28もCTLA4も樹状細胞のCD80/86に結合するが、CTLA4の方が親和性が高い
• CTLA4は、CD28と異なり、T細胞の機能を阻害する
• effector T細胞のCTLA4は、T細胞受容体とCD28を介して活性化されたT細胞のみに発現している

• PDL1（B7-H1とも知られている）：atezolizumab, avelumab, durvalumab
• PD-1を介した免疫阻害を誘導する
• T細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞に加え、リンパ組織ではない心臓や肺などの実質細胞、腫瘍細胞にも発現している
• PDL2と異なり、心内膜、膵島、胎盤の合胞体性栄養膜にもわずかに発現しており、自己免疫寛容に関わっていることが示唆される
• PDL2：未
• PDL1ほどわかっていない
• PDL2によって、PD1がT細胞受容体を介したCD4陽性T細胞の増殖やサイトカイン産生を阻害する
• PDL2を欠失したマウス由来の抗原提示細胞は、T細胞の活性化機能が増加していることから、PDL1と似たような機能を有していると考えられる
• しかしながら、樹状細胞上に集合した形で発現しているPDL2は、T細胞のPDL1 and/or PD1を阻害し、CD3とinducible T cell co-stimulator (ICOS) を増加させることが示された
• すなわち、PDL1とは独立のメカニズムでT細胞の機能を改善する可能性がある
• 他にはtable1のような分子が治療ターゲットとなっており、臨床試験が組まれている

• これらICIの有効性を予測するためのバイオマーカーがないか検討されてきた
• 腫瘍細胞におけるPDL1発現の有無は、PD1 or PDL1阻害が有効かについて有用である
• 小細胞肺がんにおいて、PD-1抗体で治療した後にT細胞が早く増加することは治療の有効性と関連していた
• また、T細胞の増加と治療前の腫瘍量の複合的マーカーは転移性メラノーマの治療反応性と関連していた
• ICIのコストや毒性を考慮すると、これら有効性に関するマーカーを特定することは非常に重要である
• これらのような免疫治療は、感染症にも有効となりうるが、まだ研究段階である
• しかしながら、微生物は、免疫から逃れるためにinhibitory 経路を利用していることがわかっており、これによれば急性・慢性感染症に対してICIも有効だと思われる
• 最近では、慢性感染症によるT細胞"enhaustion"状態に対してICIの有効性が検討されてきたが、急性感染症に対しても長期の免疫を維持するために有効かもしれない
• また、マラリア、HBV、HIVなどを含む様々な感染症に対するワクチンの開発においても、ICIが有効かもしれない
• 耐性が増えているマラリアや、生涯治療が必要なHBV, HIVにおいて新しい治療戦略となる可能性がある
• さらに、感染症に対してICIを使用する場合の有効性を予測するマーカーに関する研究も並行して必要であろう
• 今回は、HIV、HBV、結核に対するICI治療について述べていく

＜マラリア＞

Immune checkpoint proteins in malaria

• マラリアは蚊媒介性のPlasmodium属による感染症である
• 主要なのはPlasmodium falciparum、Plasmodium vivaxである
• 哺乳類の宿主において、肝臓と血液の間を循環するサイクルを形成する
• 血液内にいる間に重度の症状を呈し、高い死亡率を有する
• ここ20年間で、100種類以上のワクチンが開発されてきた
• 多くのワクチンは、肝臓stage or 血液stageにいる間を標的とした自己抗体とCD4陽性T細胞の産生を促すが、肝臓stageを標的としたCD8陽性T細胞の産生を促すワクチンは少ない
• 最も有効性を期待されるワクチンが近いうちに承認されるが、それでも接種後1年間の有効性は43.6%のみであり、4年後には16.8%まで低下する
• マラリアに対する免疫は、細胞性免疫と液性免疫の両者に依存している
• 肝臓stageに対しては、CD8陽性T細胞が排除に対して重要だと明らかになっており、CD4陽性T細胞に関しては可能性の段階である
• 血液stageでは、抗体がキーとなっていることがわかっている
• 齧歯類のマラリアモデルでは、血液stageのマラリアに対しては様々なeffectorが必要
• Th1による反応は、その中での主要な因子
• また、マラリアによる急性感染から慢性感染へ移行するのを予防するのに、CD8陽性T細胞が重要な役割を果たしている
• また、抗体とCD8陽性T細胞が、再感染に対する防御としても重要である
• さらに、マラリアに感染することで、樹状細胞が機能不全を起こし、ワクチン特異的なmemory B細胞のアポトーシスを誘導する
• ワクチンの有効性が低いのは、上記B細胞のアポトーシスに加え、マラリアに対するshort-lived immunityの関与、PD-1関与が示唆されている

Malaria and T cell exhaustion

• マラリアに関与する免疫チェックポイント関連蛋白の研究は発展途上である
• Plasmodium falciparumに感染して間もない時期に、CD4陽性T細胞とCD8陽性細胞にPD1が発現していることが示されている
• CTLA4、OX40（TNFRSF4）、GITR（TNFRSF18）、CD69に関しても、Plasmodium falciparumとPlasmodium vivax急性感染者のCD4陽性細胞で発現が増加している。TIM3（HAVCR2）もリンパ球において発言が増加している
• これは、regulatory T細胞がマラリアに対する免疫を低下させるのに関与していることを示しており、免疫チェックポイント関連治療のターゲットと考えられている
• PD-1のマラリア感染症に対する関与は、PD-1欠失マウスではPlasmodium chabaudi を迅速に排除することから明らかである
• 驚くべきことに、感染して急性期では、PD-1が、慢性感染症のコントロールに重要な寄生虫特異的CD8陽性細胞を95%も減少させることがわかっている
• また、PD-L2（BC-DC）の抑制機能も明らかとなってきた
• 樹状細胞に発現したPD-1は、マラリアに対する免疫反応を抑制するが、同じ樹状細胞に発現しているPDL2はPDL1とPD-1間の相互作用を阻害して免疫反応を改善させることが報告されている
• これは、PDL2が、マラリアを攻撃するTh1細胞性免疫を確立するのに重要な役割を担っていることを示唆している。そして、この反応はPlasmodium falciparumに感染したヒトでも見られた。
• そして、樹状細胞に発現したPDL2は、感染7日以内に減少し、血中の寄生虫の数と逆相関することもわかっており、マラリアに対する免疫反応においてPDL2が重要な役割を果たしていることを示唆している

immune cxeckpoint blockade in malaria

• 免疫グロブリンのFc領域と融合したPDL2が多量体を形成し、それをマラリアに感染したマウスに投与すると、感染症を制御し、数ヶ月間か生存期間を伸ばした
• 考えられるそのメカニズムは下の図である

• PDL1阻害とLAG3（CD223）阻害を併用すると、CD4陽性T細胞の機能を改善させ抗体価を増加させることで、Plasmodium yoelii の除去を促進した
• 抗体によってOX40シグナルを惹起することで、CD4陽性T細胞と液性免疫を改善させ、マラリア除去を促進させる
• Plasmodium berghei 感染症では、CTLA4 or PDL1抗体によってT細胞活性化が増強しIFNγ産生を増加させたが、中枢神経感染を増やした
• これは、CTLA4とPDL1阻害は、全身の寄生虫の成長と脳への進展を抑制するほど、CD4陽性T細胞の機能を改善させなかったことを意味している
• 一方で、免疫グロブリンFc領域-PDL2多量体融合蛋白は、マラリアの脳内感染を78%も減らした
• TIM3阻害も脳内マラリア感染を減らした
• Plasmodium yoelii に対する免疫反応がregulatory T細胞によって抑制されるが、GITR阻害によってこれが改善したのは、BTLA（CD272）がマラリアの脳内感染に関与していることとBTLA阻害が脳内感染を減少させたことと関係していることを示唆している

＜HIV＞
T cell exhaustion and Immune checkpoint proteins in HIV infection

• 慢性ウイルス感染症において、T細胞の疲労は重要であり、HIVも同様である
• 未治療のHIV感染症では、CD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞の両者において、PD-1, CTLA-4, TIM3, LAG3など多くの免疫チェックポイント関連蛋白の発現が増加している
• これらは、治療開始時期が早いか（6ヶ月以内）遅いか（2年以内）に関わらずARTによって発現が低下することも知られている
• 免疫チェックポイント関連蛋白の発現はT細胞のサブセットによって異なる
• central memory T細胞：PD1が増加
• regulatory T細胞：PD1、CTLA4が増加
• effector memory T細胞：LAG3が増加
• さらに、PD-1はしばしばT細胞活性化を促進するCD38やMHC class2分子と共に発現している
• HIV感染症において、HIV特異的CD8陽性T細胞と総CD8陽性T細胞においてPD1発現が増加しているのは、10年以上前に報告されている
• PD-1は細胞障害性CD8陽性T細胞にも多く発現しており、このT細胞はリンパ濾胞へ移行する
• 濾胞性CD8陽性T細胞はCXCR5とPD-1を多く発現しているが、TIM3など他の免疫チェックポイント関連蛋白の発現は増えていない
• 細胞障害性CD8陽性T細胞とHIV感染細胞は逆相関しており、PD-1阻害とPDL-1阻害はHIV特異的細胞障害性CD8陽性T細胞の機能を改善させ感染細胞を攻撃することがわかっている
• CD4 or CD8陽性T細胞に発言するPD-1と臨床経過は明らかに関係している
• HIV急性感染に続いて、CD4陽性T細胞が減少すると共にPD1発現は増加する
• ART後のCD8陽性T細胞のPD-1は、免疫不全、微小血管障害、酸化HDL・LDL、ART中断時の短期間でのウイルス再増加とも関連する。

in vivo immune checkpoint blockade for SIV and HIV infection

• サル免疫不全ウイルス（SIV）に感染した動物モデルでは、ARTで治療を受けている場合、PD-1抗体 or PDL1抗体を投与することで、SIV特異的CD8陽性細胞の増加は限られていた
• これは、PD-1抗体による有効なT細胞反応には、抗原が必要であることを示している（ARTはウイルス抗原を減らすため）
• そのため、実際にARTを投与している場合におけるICI治療については、より深く理解する必要がある
• 未治療HIVでは、PD-1と同様に、HIV特異的CD4陽性T細胞に発現しているCTLA4が増加していることは数年以上前に報告されている
• 未治療SIV感染動物では、ipilimumab（CTLA4抗体）で治療した場合、HIV複製率が増加した
• これは、SIV感染を標的にした活性化CD4陽性細胞が増加した結果と思われる
• 他のSIV感染動物の研究では、ARTにより部分的に治療されていたが、ipilimumabはHIV特異的CD4陽性細胞とCD8細胞を増加させ、リンパ節のHIV-RNAを減少させた
• これらより、CTLA4抗体は、ARTで治療していてもそれなりの有効性を示し、PD-1抗体とは異なる機序であることも示唆する
• しかしながら、ARTによって完全に治療している場合にどうなるかはわからない
• HIV感染している場合、リンパ節と血中のCD4・CD8陽性T細胞におけるLAG3も増加しており、HIV-RNAと相関・CD4陽性T細胞数と逆相関する
• CD8陽性細胞のTIGITも、健常者と比較して未治療・治療後HIVで増加している
• HIV特異的CD8陽性T細胞では、ほぼ大半がTIGIT増加しており、PD-1、CD160、2B4（CD224）も共に発現している
• TIGIT抗体とPD-1抗体を投与すると、ART治療中でもHIV特異的CD4陽性T細胞の機能が改善することがex vivoでわかっている

immune checkpoint proteins and HIV persistence

• PDL1のような免疫チェックポイント関連蛋白のリガンドを発現しており腫瘍細胞と異なり、HIV感染では、免疫チェックポイント関連蛋白自身がHIVに感染している細胞を特定する
• これは、ARTを行なっているにも関わらず残存するウイルスを除去するには非常に重要である
• この潜在的な感染は、Tfhと、memory T細胞の幹細胞を含むT細胞のサブセットや、long-lived central T細胞とtransitional memory T細胞が関わっている
• PD1発現CD4陽性T細胞とPD1発現CD8陽性T細胞が、HIVが持続的に血中・リンパ節・消化管でで陽性になることと相関していることはこれまでの研究で示されている
• PD1を発現しているCD4陽性T細胞では、PD1を発現していないCD4陽性T細胞と比較して、HIVウイルス量が10倍もあった
• これは、PD1がT細胞活性化を抑制するためHIV転写が制限され、潜在的に感染を起こすためだと思われる
• CTLA4とART治療中のウイルス持続陽性の関連はあまりわかっていない
• これらより、ICIによって、潜在的なHIV感染症を治療できるかもしれないことがわかる

• HIV感染者のCD4陽性T細胞を、ex vivoでPD-1抗体と反応させると、上清にHIV-RNAが放出された
• さらに、転移性メラノーマを有するHIV感染者にipilimumabとnivolumabを投与した際に、HIV-RNAが増加したことが報告されている

Clinical trials of immune checkpoint blockade as a strategy for curing HIV

• ARTで治療しているHIV感染症に対して（n=6）、さらにPDL1抗体を追加するphase2 trialは、腎毒性のために中止された
• HIV-RNAは変化なく、Gag特異的CD4・CD8陽性T細胞が2例において増加していた
• ICIの臨床試験は多く、HIV感染者の多数いるが、実際の臨床試験ではHIV感染症は除外基準に含まれるため、評価されることが少なかった
• そのため、今後、実臨床で効果をみていくしかない

まとめ

• HIVに対してICIが有用であるメカニズムは、HIV特異的T細胞を増加させHIVを排除すること、免疫チェックポイントマーカーを発現している感染細胞を直接的に除去すること、潜在性感染を顕在化させることが考えられている。
• また、ワクチンに対する反応性をICIがあげるため、ワクチン開発の点でも有用性が期待される。

＜HBV＞

T cell exhaustion and Immune checkpoint proteins in HBV infection

• HBV特異的T細胞は、HBV除去において急性〜慢性感染の時期において重要である
• PD-1、CTLA4、TIM3を発現しているHBV特異的CD8陽性T細胞は、急性HBV感染症で増加している

• PD1発現増加によって、肝臓内での炎症は制限され、潜在的な感染を生じる
• PD1のリガンドでありPDL1は、CD14陽性monocyteとCD19陽性B細胞をHBV慢性感染者、肝硬変、肝細胞癌患者において増加させ、それらがT細胞の疲労に関与する
• これら疲労したCD8陽性T細胞は、BIM（BCL-2L11）によってアポトーシスへ傾く
• 一方で、HBV特異的CD4陽性T細胞は、PD-1は増加しているが、CTLA4、TIM3、KLRG1、2B4は増加していない
• 最近の研究では、HBV特異的CD8陽性T細胞は、ミトコンドリアなども含む多様な経路へ関与していることがわかっている
• 慢性HBV感染者の肝臓内では、HBV特異的CD8陽性T細胞が増加しており、このT細胞はPD1とTIM3の発現も増加している
• これによって、肝臓内T細胞も疲労していく

immune checkpoint blockade as a strategy for curing HBV

• ex vivoでは、慢性HBV感染症において、PD1, CTLA4, 2B4, TIM3を阻害すると。HBV特異的CD8陽性細胞の機能が改善した
• PD-1のみ阻害すると、HBV特異的CD4陽性T細胞の機能が改善し、IFNγ、IL-2、TNFの産生が増加した
• これらによって、HBV特異的CD8細胞の増加やHBsAgに対する抗体がICIによって期待されるが、ICIは肝臓内へのT細胞浸潤を誘導し肝炎を起こすリスクも懸念される
• しかしながら、この懸念は実臨床では報告されていない
• 最近のopen-label試験では、ウイルス量がコントロールされている慢性HBV感染症患者に対して、nivolumabをHBVワクチン有と無しに分けて投与したが、安全性は問題なかった
• CheckMate 040試験でも、HBV/HCV感染症のある患者とない患者において有害事象に差はなかった
• 慢性のHBV感染症に対しても、比較的安全にnivolumabは投与できるのだろう
• しかしながら、他のPD-1阻害薬や他の免疫チェックポイントを標的にした治療で、HBV remissionを達成できるかはさらなる研究が必要

＜結核＞

• CD4陽性T細胞が、結核菌に対する免疫には必要
• TB特異的CD4陽性T細胞はIFNγ、IL-2、TNFを産生し、PD-1も発現している
• しかしながら、PD-1発現量は健常人と比較しても増加しているのはわずかである
• PD-1欠失マウスでは、結核感染による死亡リスクが増加したことが報告されている
• コントロール不可能な細菌感染を併発し、好中球浸潤を伴っていたが、T/B細胞の浸潤は少なかった
• そして、TB特異的T細胞は少なく、regulatory T細胞は増加し、間葉系幹細胞が誘導されていた
• 慢性結核感染症に対して、細菌感染がベースにある場合は、抗結核薬とICIを併用することが有用かもしれない